D538G Mutation in Estrogen Receptor-α: A Novel Mechanism for Acquired Endocrine Resistance in Breast Cancer | אונקוטסט
מאמרים בשיתוף אונקוטסט
מאמרים בשיתוף אונקוטסט
אונקוטסט > מאמרים בשיתוף אונקוטסט > D538G Mutation in Estrogen Receptor-α: A Novel Mechanism for Acquired Endocrine Resistance in Breast Cancer

עדכונים > מאמרים בשיתוף אונקוטסט

D538G Mutation in Estrogen Receptor-α: A Novel Mechanism for Acquired Endocrine Resistance in Breast Cancer

D538G Mutation in Estrogen Receptor-α: A Novel Mechanism for Acquired Endocrine Resistance in Breast Cancer

Merenbakh Lamin et al, 2013 Cancer Research

http://cancerres.aacrjournals.org/content/73/23/6856.long

Authors:

Merenbakh-Lamin Keren, Ben-Baruch Noa, Yeheskel A, Dvir Addie, Soussan-Gutman Lior, Jeselsohn Rinath, Yelensky Roman, Brown Myles, Miller Vince, Sarid David, Rizel Shulamith, Klein Baruch, Rubinek Tamar, Wolf Ido

 

מוטציה D538G בקולטן אסטרוגן α: מנגנון חדש לעמידות אנדוקרינית נרכשת בסרטן השד

 

במחקר של Merenbakh- Lamin et al. שפורסם בדצמבר 2013 ב-Сancer Research הוצג מנגנון חדש של עמידות אנדוקרינית נרכשת בסרטן שד. עמידות לטיפול אנדוקריני (הורמונלי) מתרחשת בכל החולות עם סרטן שד גרורותי חיובי לקולטן אסטרוגן αי (ERα). אך עד כה לא תוארו בספרות מוטציות נרכשות ב-ERα כמנגנונים לעמידות לטיפול. מתוך 13 מטופלות עם סרטן שד גרורתי, ב-5 מהמטופלות שפיתחו עמידות לטיפול הורמונלי, נמצאה מוטציה שגורמת להחלפת חומצה אספרטית בעמדה 538 לגליצין (D538G) והיא זוהתה בגרורות אך לא זוהתה בדגימות מהגידולים הראשוניים, שנקלחו לפני הטיפול האנדוקריני. דגם מבני של החלבון אסטרוגן הצביע על כך ש- D538G גורמת לשינוי קונפורמציה בתחום קושר הליגנד (Ligand-binding domain) שמחקה את הקונפורמציה של קולטן שהופעל ומשנה את הקשירה של טמוקסיפן. ניסויים בתאי סרטן שד איששו שפעילות השעתוק (Transcription) של קולטן D538G הינה מובנית ואינה תלויה בקשירת ליגנד, וביטוי יתר של הקולטן המוטנטי הגביר את שגשוג התאים והעניק להם עמידות לטמוקסיפן. נדרשים מחקרים נוספים להערכת השכיחות של D538G- ERα בין חולות סרטן שד ולבחינת דרכים לעיכוב פעילותו ושיקום הרגישות האנדוקרינית.

מבוא

קולטן אסטרוגן α אנושי (ERα) שייך למשפחת העל (Superfamily) של קולטנים הורמונליים גרעיניים שמתפקדים כגורמי-שעתוק תלויי ליגנד (Ligand-activated transcription factors). עם קשירתו של האסטרוגן, הקולטן עושה דימריזציה ונקשר למפעילי עזר (Coactivators). לאחר מכן כל המבנה נקשר למרכיבים מגיבים לאסטרוגן (Estrogen Responsive Elements, ERE) על גבי המקדמים (Promoters) של גני המטרה של ER. בכ-75% מסרטני השד יש ביטוי של ERα, ומסלול האיתות של ERα מהווה מטרה לטיפולים. למרות זאת ישנם מטופלים עם סרטן שד גרורתי שאינם מגיבים לטיפול אנדוקריני (עמידות  De novo), ובסופו של דבר כל החולים שמגיבים לטיפול אנדוקריני בהתחלה מפתחים עמידות (עמידות נרכשת). מוטציות ב- ERα הינן נדירות ומתרחשות רק ב-1% של הגידולים הראשוניים ואינן מקושרות עדיין לפיתוח עמידות אנדוקרינית.

במאמר מתוארת מוטציה חדשה ב- ERα, החלפה בין בסיס A ל-G בעמדה 1613, הגורמת להחלפה של חומצה אספרטית בעמדה 538 לגליצין (D538G). החוקרים מציגים עובדות המצביעות על כך שהמוטציה D538G הינה מנגנון חדש לעמידות אנדוקרינית נרכשת.

חומרים ושיטות

גיוס מטופלים לבדיקות גנטיות: דגימות של חולים עם סרטן שד גרורותי נשלחו, לפי שיקול דעתו של הרופא המטפל, לבדיקות גנטיות מסחריות, שמטרתן איתור של מטרות טיפול חדשות. מידע קליני על המטופלים נאסף מהרופא המטפל.

מבנים– יוצרו מבנים של הקולטן המוטנטי 538G-ER ו-pcDNA3 ER-WT ע”י תשבוט (Subclone) עם תחילים (Primers) וערכה (Kit) להשריית מוטציה. וקטור (Vector) של ביטוי ER שימש כתבנית ל-PCR. כל המבנים המתושבטים רוצפו.

תאים-  תאים (מ-2 סוגים) תורבתו וגודלו ולאחר נחשפו לכימיקלים הבאים: 17b-estradiol , (4-HT) hydroxytamoxifen-4 , Fulvestrant. כל התאים שהודגרו עברו המסה ומיצוי חלבונים לביצוע בדיקת תספיג חלבון (Western blot analysis) עם הנוגדנים: anti-Era, anti p-ERa, anti-SRC-1.  נעשו בדיקות של שקיעת חלבונים אימונית  (Imunoprecipitation) עם הוגרת חלבון עם  נוגדן anti-SRC-1 במשך הלילה ב4 מעלות. לאחר מכן הוספו חרוזי חלבון G/A לשעתיים. לאחר שטיפות החומרים ששקעו עברו בדיקת תספיג חלבון.

בדיקות עם ערכת לוציפראז- הבדיקות בוצעו על תאים שעברו החדרת גנים (Transfection) של 538G-ER וpcDNA3 ER-WT. הוכן רנ”א מלא שעבר שעתוק הפוך ל-cDNA ובוצע PCR כמותי בזמן אמת.

בדיקות שגשוג ונדידה (Migration)- לשם בדיקת MTT לשגשוג תאים הוחדרו גנים WT-ERα, או 538G-ER או וקטור ביקורת. הנדידה נבחנה ע”י מבחן ריפוי הפצע (Scratch): צילום התאים 48 שע’ לאחר גירוד שכבת תאים בודדת.

יצירת דגם מבני- הקולטן D538G-ERα נבנה פעמיים: (1) קונפורמציה בקשירת אסטרוגן, (2) קונפורמציה בקשירת טמוקסיפן. הבניה נעשתה ע”י Jackal בשרת FFAS וליטושים בוצעו בפרוטוקול Relax של גרסת Rosetta 3.4. כ-1000 דגמים נבנו לכל דגם-אב ראשוני ואז אוגדו לאשכולות בפרוטוקול Rosetta. נציג האשכול הגדול ביותר נבחר להמשך ניתוח. גם המבנה Wild Type)  WT) בקונפורמציה בקשירת אסטרוגן הורכב.

עגינה (Docking) מולקולרית של אסטרוגן וטמוקסיפן נבדקה עבור 2 הקונפורמציות ע”י גרסת Dock 6.5 ו-SwissDock. 2 הגרסאות נתנו תוצאות זהות. בנוסף אסטרוגן וטמוקסיפן עוגנו על מבני WT לתיקוף השיטה, עם ובלי הפפטיד SRC-1.

תוצאות

זיהוי מוטציה D538G ב-ERα בדגימות סרטן שד

מדצמבר 2011 לאפריל 2013, דגימות של 13 מטופלים ישראלים עם סרטן פולשני דוקטלי (infiltrating ductal carcinoma) חיובי ל-ERα , שנכשלו בקווי טיפול רבים, נשלחו לניתוח גנטי במטרה לזהות אפשרויות טיפול חדשות. מוטציה חדשה (A1613G), המובילה להחלפת D538G ב- ERα, התגלתה ב-5 מהחולים (38%). חשוב לציין, שהמוטציה לא זוהתה בגידולים הראשוניים של החולים, לפני התחלת הטיפול האנדוקריני. כל 5 החולים קיבלו לפחות 2 קווים של טיפול אנדוקריני ממושך (67-97 חודשים) לפני פיתוח העמידות. שכיחות האלל המוטנטי נעה בין 16%-41% בהתאם לאחוז התאים הסרטניים בדגימה.

כל הדגימות עם המוטציה נלקחו מגרורות כבדיות. לעומת זאת, רק 1 מ-8 הדגימות עם WT- ERα הייתה מהכבד, כשכל השאר מעצם ורקמות רכות (p=0.005 בין הקבוצות). בחולה אחת עם המוטציה, זוהו גרורות בריאה, שנבדקו במקביל ולא נשאו את המוטציה.

דגם מבני של D538G- ERα

Asp-538 נמצא במקום חיוני בתחום קושר הליגנד, ששמו הליקס (Helix 12). במבנה קריסטלי של WT- ERα, להליקס 12 תפקיד חשוב באינטראקציה של הקולטן עם מפעילי עזר שונים. בדגם D538G- ERα הקונפורמציה של הליקס 12 זהה לזו שב- WT- ERα לאחר קשירת  אסטרוגן. הדגם של D538G- ERα הדגים שינוי קונפורמציה בהליקס 12, המאפשר קשירת מפעילי עזר בהיעדר אסטרוגן ומפריע לקשירת אסטרוגן וטמוקסיפן. ייתכן ושינויים ברשת קשרי המימן, יכולים ליצור גמישות יתר בהליקס 12, וכך לאפשר קשירת מפעילי עזר בהיעדר ליגנד. קולטן ה-WT הינו בעל מבנה קשיח, ההחלפה D538G מאפשרת לו להיות יותר גמיש ולכן האפיניות שלו לטמוקסיפן נמוכה.

פעילות השעתוק הבלתי תלויה בליגנד של D538G- ERα

פעילות השעתוק של הקולטן המוטנטי נצפתה ע”י מבחן לוציפראז בתאים שאליהן הוחדרו הגנים ERα  WT- או  538G- ERα. התאים גודלו במצע ללא אסטרוגן ולאחר חלקם טופלו ב-E2י (17b-estradiol).  בהיעדר E2, תאי WT- ERα הגדילו פעילות שעתוק  פי 10 לעומת תאי pcDNA3, בעוד שתאי 538G- ERα הגדילו פעילות פי 45. ביטוי יתר של 538G- ERα הגדיל פעילות שעתוק פי 11 לעומת תאי pcDNA3י (p=0.0002) או WT- ERαי (p=0.0004) . טיפול עם E2 הגדיל את הפעילות בתאי pcDNA3 ותאי WT- ERα אך לא בתאי 538G- ERα.

להערכה נוספת של פעילות השעתוק, בדקו את הגנים PR, GREB1, TGF-α שמווסתים ע”י ERα. ביטוי 538G- ERα הגדיל רמות רנ”א שליח (mRNA) של PR פי 15.7, של GREB1 פי 28, לעומת תאים עם pcDNA3 ופי 3 ופי 4, בהתאמה, לעומת תאי WT- ERαי (p<0.01 בכל ההשוואות). גם ביטוי TGF-α mRNA גדל (0.01p=).

D538G- ERα נקשר ל- SRC-1 ללא תלות בליגנד אך לא משפיע על זרחון Tyr537

בעוד ש- WT- ERα נקשר ל-SRC-1 (מפעיל עזר) רק לאחר חשיפה  ל-E2, D538G- ERα נקשר אליו ללא תלות בליגנד. יש לציין שידוע שזירחון Tyr537 מעכב את ERα והחלפתו ב-Asn קשורה לפעילות מוגברת של הקולטן. על ידי שימוש בנוגדן ל-Tyr537 מזורחן, הוכח שאין שינוי בדפוס הזירחון בקולטן המוטנטי, מה שמצביע על כך שהפעילות המוגברת של D538G אינה מתווכת ע”י שינוי בזירחון של טירוזין 537.

D538G- ERα מגביר שגשוג ונדידה של תאי סרטן שד

כאמור, תאים עברו החדרת גן עם ווקטור ביקורת, WT- ERα וD538G- ERα, גדלו על מצע ללא אסטרוגן ול-48 שע’ חלקם נחשפו ל-E2. בבדיקת MTT נבדקה חיוניות התאים. 538G- ERα הגביר שגשוג תאים ב-33% בתאים שלא נחשפו ל-2E וב-28% בתאים שנחשפו ל-E2י (p=0.01 ל2 ההשוואות).  בבדיקת נדידה ע”י מבחן ריפוי הפצע החוקרים הראו ש-538G- ERα הגביר נדידה בכל התאים (שנחשפו או לא נחשפו ל-E2) בהשוואה ל-pcDNA3 או WT-ERα.

D538G- ERα עמיד לטמוקסיפן ול-Fulvestrant

נבדקה היכולת של חליף (Metabolite) של טמוקסיפן, 4-HT, ושל מעכב קולטן אסטרוגן בררני, Fulvestrantלעכב את פעילות השעתוק של 538G- ERα. לשם כך נלקחו תאים ללא קולטן לאסטרוגן שאליהם הועברו pcDNA3 או 538G- ERα והם גודלו במצע ללא אסטרוגן ונחשפו לחומרים. הקולטן המוטנטי הדגים עמידות יחסית לשניהם.

דיון

במאמר זה מראים בפעם הראשונה, שעמידות נרכשת לטיפול אנדוקריני בסרטן שד גרורותי יכולה להיות תוצר של מוטצייה מאקטבת של ERα. בספרות עד כה תוארו 2 מוטציות מאקטבות של הקולטן, Y537N  ו-K303R, שמתרחשות בפחות מ-1% מהגידולים הראשוניים. לידיעת החוקרים מוטציה D538G לא תוארה לפני כן ואף לא זוהו מוטציות נרכשות אחרות של ERα  . לכך יכולים להיות 2 הסברים: (1) מחקרים קודמים התמקדו בנוכחות מוטציות בגידולים הראשוניים באבחנה, ולכן לא יכלו לזהות מוטציות נרכשות בגרורות, (2) ייתכן ושיטות ריצוף קודמות היו פחות רגישות מהשיטות הנוכחיות.

חשוב לציין שהמטופלים במחקר נבחרו בקפידה, קיבלו טיפול ממושך קודם וייתכן ואינם מייצגים את אוכלוסיית חולי סרטן השד הכללית. את השכיחות האמיתית של המוטציה יש לקבוע בקבוצות עוקבה גדולות. אם אכן המוטציה תזוהה בחלק גדול מהחולים, בדיקה ישירה שלה יכולה להיות דרך קלה וזולה לניבוי תגובה לטיפול.

הליקס 12 באתר קושר הליגנד הוא בעל תפקיד מפתח בפעילות ER ובאינטרקציה שלו עם E2, מפעילי עזר ומעכבים. מוטציות בהליקס 12 טרם זוהו בדגימות קליניות, אך ישנו מידע מעבדתי נרחב על תפקידי ח’ אמינו באתר.  רוב החלפות חומצות האמינו לא משנות או מורידות את פעילות השעתוק (לדוג’ D538A, החלפות Tyr-537). עם זאת ישנן מספר דוגמאות של אקטוב יתר ועמידות למעכבים (מוטציות ב-Leu-536 והחלפת Glu-542 לאלנין). לפיכך הפעילות הבלתי תלויה בליגנד של D538G- ERα מתאימה לידוע כיום על מבנה ותפקוד הליקס 12.

D538G- ERα מגביר חיוניות ונדידה של תאים, אפילו בהשוואה לגירוי E2. לא ברור המנגנון של התופעה והאם היא תורמת למהלך קליני יותר אלים עם רכישת המוטציה. ידוע שקשירת E2  גורמת לזמן מחצית החיים של הקולטן להתקצר מ-5 ימים ל3 שעות כמנגנון משוב שלילי. ייתכן, שבהעדר הקשירה בקולטן המוטנטי זמן מחצית החיים של הקולטן מתארך ופעילות הקולטן מתגברת.

למרות שלא דווחו מוטציות נרכשות של ERα בקליניקה, סדרת מאמרים ממעבדות Craig Jordan תיארו מוטציה נרכשת בחי (In vivo)י, D351Y, שהפתחה בתאים שגודלו כגידולים בעכברים חסרי טימוס תחת טיפול כרוני בטמוקסיפן. זוהי הוכחה מעבדתית חשובה לתצפית הקלינית במאמר זה. אם כי D351 לא שוכן בהליקס 12, בקשירת E2, D351 נמצא בסמוך ל- D538 ובעל תפקיד חשוב בבקרת פעילות תלויה ובלתי תלויה ב-E2 ובתיווך השפעות אגוניסטיות של טמוקסיפן.

העובדה שהמוטציה זוהתה רק בגרורות כבד ובאחד החולים, למרות שזוהתה בגרורות בכבד לא זוהתה בגרורות הריאתיות, ושב-8 חולים ללא המוטציה, חוץ מדגימה אחת שאר הדגימות נלקחו מאתרים חוץ-כבדיים, יכולה להצביע על נטיה מיוחדת של התאים עם איתות אסטרוגני פעיל לכבד. טרופיזם של תאי סרטן שד לאיברים מסוימים, כמו ריאות, עצמות ומח הינה תופעה מוכרת היטב. בנוסף למחקר הזה, מחקר אחר לאחרונה הצביע על קשר בין ביטוי קולטני הורמונים וגרורות כבדיות. מדובר על תצפית מוקדמת ודורש תיקוף במחקר עוקבה גדול יותר.

התצפית במחקר מצביעה בבירור שניתוחים גנומיים המיועדים לנבא תגובה לטיפול וזיהוי מטרות טיפול חדשות צריכים להתבצע על הנגעים הגרורותיים האחרונים הנגישים. עדיף, שגם הגידול הראשוני וגם הגרורות יעברו הערכה. כל החולים במחקר פיתחו עמידות למספר סוגים של טיפולים אנדוקריניים. המחקרים על שורות התאים הראו שגם טמוקסיפן וגם fulvestrant מסוגלים לעכב את הקולטן המוטנטי בריכוזים גבוהים, על-פרמקולוגיים, כך שלמעשה התאים עמידים לטיפול. עדיין מדובר בעובדה מעודדת שמצביעה על כך שייתכן שמרכיבים אחרים יוכלו להיקשר לקולטן, למנוע את הפעלתו ולשקם את הרגישות האנדוקרינית שלו.

סיכום

החוקרים במאמר זיהו מוטציה נרכשת חדשה של ERα בגרורות שנדגמו מחולי סרטן שד גרורתי עם עמידות נרכשת לטיפול אנדוקריני. המוטציה מביאה לשינוי קונפורמציה, המחקה את הקונפורמציה של קולטן ששופעל ע”י ליגנד, הגורמת לפעילות בלתי תלויה בליגנד ולעמידות לטיפול אנדוקריני. הגילוי הזה יכול להוביל לפיתוח של טיפולים אנדוקריניים חדשים עבור חולים העמידים לטיפולים האנדוקריניים הקיימים כיום.

D538G Mutation in Estrogen Receptor-α: A Novel Mechanism for Acquired Endocrine Resistance in Breast Cancer

Cancer Research 2013

Merenbakh-Lamin Keren, Ben-Baruch Noa, Yeheskel A, Dvir Addie, Soussan-Gutman Lior, Jeselsohn Rinath, Yelensky Roman, Brown Myles, Miller Vince, Sarid David, Rizel Shulamith, Klein Baruch, Rubinek Tamar, Wolf Ido

צור קשר